WWW.LIBRUS.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - собрание публикаций
 

«ОЦЕНКА НАТИВНОСТИ ПРОТОПЛАСТОВ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ А.П. Кудряшов, М.П. Шапчиц Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь На современном этапе развития биотехнологии препараты ...»

Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры

УДК 587.352.4

ОЦЕНКА НАТИВНОСТИ ПРОТОПЛАСТОВ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

А.П. Кудряшов, М.П. Шапчиц

Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь

На современном этапе развития биотехнологии препараты растительных клеток и

протопластов широко используются для научных исследований и в биотехнологических

процессах [1]. В протопласты можно относительно просто вводить не только чужеродную ДНК, но и компоненты большего размера – органеллы (например хлоропласты), что может существенно повысить продуктивность сельскохозяйственных культур [2] .

Культуры клеток и тканей растений используют для получения природных соединений уже более 20 лет. Применение культур растительных клеток в промышленных масштабах сопряжено с рядом проблем, которые отчасти решаются при использовании препаратов иммобилизованных клеток (многократное использование клеток, более высокая плотность биомассы, повышение продукции и экскреции вторичных метаболитов и др. [3]) .

Для решения указанных задач необходимо получать из растений препараты клеток и протопластов с неповрежденными органеллами, сохраненными функциями плазматической мембраны и процессами метаболизма. Поэтому в этих случаях актуальны как подбор реактивов и режимов обработки исходного растительного материала, так и оценка нативности получаемых протопластов и клеток в препаратах. В связи с этим в настоящей работе была поставлена цель провести анализ и подбор методов, позволяющих экспрессно определить нативность получаемых растительных протопластов и иммобилизованных клеток .

Объекты и методы исследования. Протопласты выделялись из молодых листьев растений шести видов: Drimiopsis maculata, Begonia Feastii, Begonia Tiger, Setcreasea purpurea, Aloe jucunda и Nicotiana tabacum. Подбор растений определялся цитологическими различиями, доступностью материала, способностью к регенерации и рядом других характеристик. Для выделения протопластов использовался водный раствор ферментного препарата, в состав которого входили пектиназа (0,5 ед/мг) и целлюлаза «Onozuka R-10» (1,8 ед/мг), концентрации указанных ферментов составляли 2% и 0,5% соответственно, хлорид кальция ·10 –3 М), манит (0,4 М). Значение кислотности (5 ферментного препарата поддерживалось буферной смесью МЕS–Tris на уровне рН 5,6 .

Условия выделения протопластов подбирались путем варьирования температуры и времени экспозиции листовых фрагментов в ферментном препарате индивидуально для каждого из видов растений. С листовых пластинок Drimiopsis и Setcreasea снимался эпидермис и фрагменты листьев стороной, свободной от эпидермиса, помещался на поверхность жидкости, содержащей ферментный препарат в чашки Петри. С листьев Begonia эпидермис снимается плохо, а на поверхности листа Nicotiana он очень тонкий и не препятствует проникновению ферментов к клеткам мезофилла листа, поэтому фрагменты интактных листьев указанные растений помещались чашки Петри. Из листьев же Aloe полностью удалялся эпидермис вместе с прилежащим к нему фотосинтезирующим мезофиллом, и оставлялись только внутренние водозапасающие ткани .

После экспонирования листьев в растворе с ферментами остатки неразрушенных тканей удалялись, а протопласты осаждались в течение 15–20 мин. При работе с протопластами, выделяемых из листьев Begonia, для осаждения применялось центрифугирование (10 мин при 500 g). Протопласты Begonia оказались устойчивыми к такого рода воздействиям, в то время как протопласты из других растений характеризовались высокой степенью их повреждения после центрифугирования .





Осаждение протопластов из других видов растений проводилось естественным путем в Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры течение довольно продолжительного времени. Осажденные протопласты несколько раз промывались средой (Ср. 2), имеющей значение рН 7,8 и не содержащей как ферментов, так и ионо в Са2+ (слабощелочная реакция среды без Са2+ позволяет инактивировать остатки ферментов). В то же время в состав Ср. 2 входил 2 –3 М MgCl2. В конечном ·10 итоге протопласты переносились в среду (Ср. 3), содержащую 2 –3 М CaCl2, 2· 10–4 М ·10 М NaCl и 0,5 М маннита, при рН 7,8, которая позволяла поддержать

–3 KCl, 2 ·10 жизнеспособность протопластов на время исследований .

Препараты иммобилизованных растительных клеток получали из суспензионных культур Nicotiana tabacum и Syringa vulgaris. Для иммобилизации клеток суспензионных культур Nicotiana tabacum и Syringa vulgaris применялся метод их включения в гель альгината кальция. Этот метод прост, гель обладает достаточной механической прочностью в то же время отмечается высокая степень удерживания клеток в полисахаридном матриксе, а условия включения их в гель «мягкие», в результате чего последние сохраняют жизнеспособность. Для иммобилизации в альгинатном геле осажденные суспензионные культуры табака и сирени ресуспендировали в растворе сахарозы (20 г/л) для предотвращения плазмолиза клеток или в ростовой среде, используемой для поддержания роста данных культур. Суспензию клеток смешивали с 2раствором альгината натрия в пропорции 1: 1, после чего полученную смесь с помощью шприца по каплям добавляли в охлажденный 0,25 М раствор хлорида кальция .

При этом формировались сферические гранулы диаметром 4-5 мм. Полученные гранулы выдерживали 20 мин для стабилизации при 4 °С и затем промывали дистиллированной водой .

Для окрашивания нейтральным красным (НК) к суспензии протопластов, находящихся в Ср. 3, добавлялось несколько капель 2 % спиртового раствора красителя. В растворе НК протопласты выдерживались 10–15 мин. Окрашивание клеток каллусных и суспензионных культур и препаратов иммобилизованных клеток осуществлялось при рН 8,5-9 и выше (величину рН регулировали с помощью 0,1 %-ного раствора КОН) в течение 20-30 мин. Окрашивание протопластов диацетатом флюоресцеина (ДФ) производилось путем их 15 мин инкубации в 3·10 –3 М растворе красителя и последующего многократного отмывания. Интенсивность флюоресценции суспензии протопластов измерялась при помощи флюоресцентного спектрофотометра Cary Eclipse varian при возбуждении светом с длиной волны 490 нм .

Подсчет количества протопластов и клеток в суспензии производился при помощи камеры Горяева. При определении количества иммобилизованных клеток производилось определения среднего их содержания в давленых препаратах (гранулах) в поле зрения микроскопа. Для достижения надежности и воспроизводимости результатов, а так же возможности дальнейшего культивирования полученных протопластов, все манипуляции проводились со стерильными средами в асептических условиях в ламинар-боксе. Основы среды стерилизовались автоклавированием, а ферментный препарат асептизировался фильтрацией через стерильные мембранные фильтры с диаметром пор 0,25 мкм .

Результаты и обсуждение. Самую достоверную оценку нативности растительных клеток и протопластов дает изучение их способности к регенерации клеточной стенки, делению и последующему органогенезу. Однако эти методы трудоемки, а на постановку подобного рода исследований уходит много времени. Предлагается ряд экспресс-методов, которые позволяют с достаточно высокой достоверностью подсчитать процент жизнеспособных протопластов и клеток в суспензии. Эти методы основываются главным образом на регистрации метаболической активности, а также целостности и нативности плазматической мембраны клеток и протопластов. В наших исследованиях препараты клеток и протопластов тестировались на сохранение жизнеспособности путем окраски их витальными красителями (НК и ДФ), а также по результатам наблюдения за набуханием их в гипотонических средах (тест на сохранение осмотических свойств) .

Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры По литературным сведениям достаточно часто для выявления сохранения биохимических процессов предлагается использовать различного рода витальные красители, которые изменяют свои оптические свойства в результате химических модификаций их структуры, происходящих с участием ферментов, например диацетат флюресцеина. Это нефлюоресцирующее соединение, которое легко проникает через биомембраны, и, попадая в клетку, расщепляется неспецифическими эстеразами, до высвобождения флюоресцеина. Флюоресцеин плохо проникает через биомембраны, что способствует его аккумуляции в живой клетке. Обнаружить же флюоресцеин можно по характерной для него флюоресценции. Метод оценки жизнеспособности растительных клеток по их окраске диацетатом флюресцеина является достаточно популярным среди исследователей [4]. Однако его применимость для экспрессной оценки жизнеспособности растительных протопластов сомнительна, поскольку в этом случае требуется тщательная отмывка протопластов от ферментного препарата и обломков разрушенных клеток .

Эстеразы могут присутствовать как в ферментных препаратах в виде примесей, так и в среде (выделяются в среду из разрушенных клеток). Действительно нами обнаружено достаточно сильная флюоресценция среды, в которой суспендировались протопласты из водозапасающей ткани Aloe jucunda (клетки этой ткани практически лишены хлоропластов). Причем, это свечение было заметным даже после троекратного отмыва протопластов. Так у среды с удаленными протопластами интенсивность флюоресценции составляла почти 27% от исходной характерной для суспензии протопластов. По нашему мнению такое явление связано с высвобождением эстераз при разрушении протопластов, во время процедур их выделения и отмыва. Кроме того, для оценки нативности протопластов указанным методом требуется дополнительное оборудование (флуоресцентный спектрофотометр или флуоресцентный микроскоп) или другие приспособления для подобного рода исследований. Причем прямое визуальное (под микроскопом) наблюдение флюоресценции у клеток, содержащих антоцианы или хлоропласты затруднено .

Следующая группа методов экспрессной оценки растительных протопластов и клеток базируется на проверке сохранения функций их плазматической мембраны .

Обычно в этих процедурах оценивается сохранение барьерно-транспорных свойств плазмалеммы. Липидный бислой плазматической мембраны слабо проницаем по отношению к полярным молекулам и относительно хорошо пропускает молекулы воды и неполярных соединений. В связи с возможностью легкого проникновения воды через мембрану для интактных клеток и протопластов должны быть характерны осмотические явления .

Кроме этого способа оценить сохранение функций плазмалеммы и тонопласта можно с помощью витального красителя нейтрального красного. Кислотно-основной индикатор нейтральный красный характеризуется тем, что изменение его цвета (от интенсивно красного до бледно желтого) происходит при сдвиге рН в пределах значений от 6,8 до 8,0, что соответствует закономерностям ионизации его молекул .

Неионизированные молекулы нейтрального красного, которые преобладают в слабо щелочных растворах, характеризующихся бледно желтой окраской, легко проникают через биологические мембраны. Трансмембранный же перенос ионизированных форм нейтрального красного, которые преобладают в кислых средах, затруднен. Таким образом, скорость поступления через мембрану в клетку молекул НК из среды, должны зависеть от рН последней. Кроме того, при достижении равновесия, т. е. когда потоки вещества, направленные внутрь клетки и из неё в среду уравняются, возможна такая ситуация, что будет отмечаться неравенство концентраций красителя в среде и в компартменте, окруженном мембраной (протопласте или клетке).

Если предположить, что через мембрану проникают только электрически нейтральные молекулы слабого основания, то нетрудно показать, что ионизированный ([R+])i нейтральный красный должен распределяться в системе клетка–среда в зависимости от соотношения величин их рН:

Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры [R+ ]к / [R+ ]с = [H+]к / [H+]с 10(рНс – рНк) где квадратный скобки отражают молярные концентрации ионизированных форм нейтрального красного (R+) и ионов водорода, а подстрочный индекс относится к клетке или среде .

Разумеется, в реальной ситуации через мембрану способны диффундировать и ионизированные формы нейтрального красного, поэтому невозможно достичь, например, 100 кратного градиента концентраций слабого основания при различиях в величинах рН на 2 ед, однако и при наблюдаемом различии коэффициентов проницаемости мембраны для ионизированных и неионизированных форм слабого основания должна отмечаться заметная аккумуляция последнего в «кислом компартменте» клетки, например, в вакуоли .

Метаболизирующие клетки растений характеризуются наличием градиента рН между вакуолью и цитоплазмой. Содержимое вакуоли имеет кислую реакцию (рН 5,5 или ниже). В связи с этим в жизнеспособных клетках растений, помещенных в слабощелочной раствор нейтрального красного, последний должен аккумулироваться в вакуолях, что проявляется в интенсивной окраске клеток в малиново-красный цвет. Таким образом, при окрашивании растительных клеток и протопластов нейтральным красным тестируется не только сохранение функций мембран, но и нативное распределение кислотности, характерное для живой клетки .

–  –  –

Оценка нативности протопластов, получаемых из листьев различных растений при варьировании временных и температурных режимов, по их набуханию и способности окашиваться нейтральным красным в целом дали практически одинаковые результаты (табл.). Однако, более половины протопластов выделяемых при суточной экспозиции из Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры листовых фрагментов Setcreasea окрашивалось нейтральным красным, в то время как в гипотонической среде набухало лишь 20,4% протопластов. Вероятно, нативность плазмалеммы более точно отражают данные, полученные на основе оценки ее осмотических свойств. Некоторые протопласты из листьев Begonia окрашены в красный цвет содержащимися в них антоцианами, в связи с этим оценка их нативности производилась лишь по набуханию в гипотонической среде .

Не менее важно экспрессно получать сведения и о состоянии иммобилизованных клеток. Ведь во время процедур иммобилизации они подвергаются ряду повреждающих факторов [4]. Не исключено, что в результате такого рода воздействия часть клеток может быть повреждена настолько, что утратят способность к регенерации. Использование явлений плазмолиза и деплазмолиза для оценки нативности растительных иммобилизованных клеток затруднено, поскольку носитель (в нашем случае гель альгината кальция) обладает ограниченной прозрачностью. В этом случае наблюдении осмотических явлений возможно лишь для клеток находящихся у поверхности гранул .

Основная же масса клеток при значительном увеличении микроскопа плохо различима .

По указанной причине для оценки нативности клеток включенных в альгинатный гель использовалось их окрашивание нейтральным красным в слабо щелочных растворах. В этом случае живые клетки интенсивно окрашивались в малиново-красный цвет, а материал носителя оставался неокрашенным (рис. 1). Именно эта ситуация позволяла без особого труда производить подсчет метаболизирующих клеток, включенных в альгинатный гель: хотя альгинат кальция заметно рассеивает свет, однако в нем при небольшом увеличении (50–100 х) можно различить (подобно сигналу светофора в тумане) и подсчитать яркие красные пятна, соответствующие положению клеток включенных в гель. (рис. 1) .

–  –  –

Следует отметить исключительное удобство указанного способа оценки нативности клеток включенных в гранулы альгинатного геля. При небольшом увеличении гранула почти польностью находиться в поле зрения микроскопа, в то же время в ней отчетливо различаются окрашенные НК живые клетки, а на периферии возможно наблюдение и Труды БГУ 2010, том 4, выпуск 2 Обзоры материала, утратившего интактность. Опытный исследователь по степени окраски гранул препарата может оценить относительное его качество. Разумеется, для более детальной оценки необходимо провести разрушение гранул и высвобождение из иммобилизованного состояния. Причем, проведение, этой процедуры вполне возможно после окрашивания иммобилизованных клеток. Разрушение гранул альгината кальция можно осуществить как механически, так и химически. В последнем случае используются буферные растворы сдвигающие рН среды (например фосфатный буфер). Подобная процедура позволяет выделить клетки из гранул геля, причем при их высвобождении не отмечается потеря окраски .

Выводы. Анализируя применимость различных методов оценки нативности протопластов, следует отметить, что наиболее пригодным в использовании оказался метод деплазмолиза. Он достаточно точно (из используемых) демонстрирует сохранение барьено–транспортной функции плазмалеммы. Метод окраски нейтральным красным более нагляден, удобен и во многих случаях дает вполне согласующиеся с полученными по набуханию протопластов оценками результаты анализа, однако при наличии в клетках антоцианов проведение достоверной оценки жизнеспособности протопластов затруднено .

Кроме того, в отдельных случаях (протопластов из Setcreasea) результаты оценки нативности этим методом не совпадали с таковыми на основании способности протопластов набухать в гипотонических средах .

В то же время метод окраски нейтральным красным позволяет без труда выявить и подсчитать количество нативных растительных клеток в суспензии или включенных в альгинатный гель. Кроме того, метод окраски нейтральным красным относительно прост и позволяет более детально определить нативность препарата: оценить не только сохранение функций плазмалеммы, но и наличие градиента рН между вакуолью и цитоплазмой. При проведении экспересс оценки нативности растительных клеток и протопластов в каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход .

Оценка нативности протопластов с помощью диацетата флюресцеина затруднена изза обязательного наличия в среде с суспендированными протопластами эстераз, катализирующих образование флюоресцеина. Непосредственное же наблюдение флюоресценции отдельных клеток требует специального оборудования .

Список литературы Джардемалиев Ж. К. Деление протопластов, выделенных из клетое суспензионной 1 .

культуры пшеницы Triticum aetstivum (L)/ Джардемалиев Ж. К., Карабаев М. К., Мухаметкалиев М. Т., Бутенко Р. Г. // Физиол. растений. 1992. т. 39. вып. 1. С. 135–142 Бекер М. Е. Биотехнология / Бекер М. Е., Клиепиныш Г. К., Райпулис Е. П.. – M .

2 .

1990. 451 c,

3. Akimoto C. / Endogenous elicitor-like effects of alginate on physiological activities of plant cells / Akimoto C., Aoyagi H., Tanaka H. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. Vol. 52. P .

429-436 .

Бодей С.П. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Бодей С.П., Кабрал 4.



Похожие работы:

«. ПОЛОЖЕНИЕ о Спартакиаде пенсионеров Вологодского регионального отделения общероссийской общественной организации "Союз пенсионеров России" в 2018 году 1.Общее положение Спартакиада Вологодского регионального отделения общероссийской общественной организации "Союз пенсионеров России" проводится в соот...»

«Содержание 1. Целевой раздел С тр. Пояснительная записка 1.1. 3 Цели, задачи и принципы реализации Программы 1.2. Значимые для разработки и реализации Программы характеристики: 4 1.2.1. Демографические особенности 4 1.2....»

«Приложение 18 ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА ПРИ ИЗУЧЕНИИ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА "ИСКУССТВО (ОТЕЧЕСТВЕННАЯ И МИРОВАЯ ХУДОЖЕСТВЕННАЯ КУЛЬТУРА)" 1 . Учебные программы В 2019/2020 учебном году используются следующие учебные программы:V–VII классы: Вучэбная праграма для...»

«Пояснительная записка Данная программа ставит своей целью научить правильным приемам игры на баяне, аккордеоне и дать общемузыкальное развитие. Таким образом решая вопросы эстетического развития детей средствами музыкального искусства через обучение инструментальному испо...»

«У ТВ ЕРЖДАЮ У ТВ ЕРЖДАЮ Заместитель министра спорта Министр физической культуры, Российской Федерации спорта, туризма и работы с молодежью Московской области /М.В. Томилова/ _/Р.И. Терюшков/ "" 2018 года "" 2018 года СОГЛАСОВАНО СОГЛАСОВАНО СОГЛАСОВАНО Президент Федерации Глава Администрации СергиевГенеральный д...»

«МИНИСТЕРСТВО ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ РФ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ (МИИГ) Кафедра философии и культурологии КУЛЬТУРА ДРЕВНЕЙ РУСИ ХШ-ХУ ВЕКОВ Москва 1994 УДК 6 8 1.3.0 6 :6 5 6.2 :3...»

«ТВОРЧЕСТВО УМ МОДА РОССИЯ БУДУЩЕЕ ВДОХНОВЕНИЕ ИННОВАЦИИ АВАНГАРД ПРЕЗЕНТАЦИЯ И ПОРТФОЛИО 2019 ВСТУПИТЕЛЬНОЕ СЛОВО: " Креативная мастерская Letie – это творческое объединение и мульти...»

«Acta Biologica Sibirica, 2019, 5(2), 138–144, doi: https://doi.org/ 10.14258/abs.v5.i2.6209. RESEARCH ARTICLE UDC 638.42+631.92(470.2) Distribution of ants (Hymenoptera, Formicidae) in the agrolandscape of Northwestern Russia O.G. Guseva, A.G. Koval All-Russian Institute of Plant Protection Podbelskogo, 3, St. Petersburg, Pushkin, 196...»







 
2019 www.librus.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - собрание публикаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.