WWW.LIBRUS.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - собрание публикаций
 

«Жетысуский государственный университет им. И. Жансугурова, Талдыкорган, Казахстан; Институт общей генетики и цитологии КН МОН РК, Алматы, Казахстан (E-mail: bahtaulova ...»

УДК 582.734.3

А.С. Бахтаулова1, Б. Бекманов2, Ж.Ж. Канагатов1

Жетысуский государственный университет им. И. Жансугурова, Талдыкорган, Казахстан;

Институт общей генетики и цитологии КН МОН РК, Алматы, Казахстан

(E-mail: bahtaulova@mail.ru)

Молекулярно-генетический анализ разнообразия дикой яблони

(Malus sieversii Ledeb. M. Roem.) с помощью ДНК-маркеров

Malus sieversii зaнимaeт oсoбoe мeстo в числe цeнных рaститeльных видoв Жoнгaр-Aлaтaускoгo

ГУ

гoсудaрствeннoгo нaциoнaльнoгo прирoднoгo пaркa. Она фoрмирует знaчитeльныe (1,05 % oт плoщaди пaркa) мaссивы дикoплoдoвых нaсaждeний. Для сохранения яблоневых лесов проведены исследования современного состояния насаждений генетических резерватов яблони Сиверса на территории парка, созданы дизайн и синтез праймеров для молекулярно-генетического анализа, дана генетическая характеристика образцов ДНК с помощью ISSR-маркеров, выполнен анализ и интерпретация результатов молекулярно-генетического исследования. Молекулярно-генетический анализ разр нообразия дикой яблони обеспечит основу для устойчивого развития естественных популяций яблони Сиверса путем выращивания генетически однородного посадочного материала. Исследования направлены на сохранение уникального генофонда яблоневых лесов для селекции и восстановления кульКа турных сортов .

Ключевые слова: яблоня Сиверса, популяция, сохранение, генетический резерват, ISSR-маркер, молекулярно-генетический анализ .

Актуальность й Известно, что оригинальные дикие предки современных яблонь (Malus sieversii Ledeb .

M. Roem.) ри произрастают в условиях Заилийского Алатау, Джунгарского Алатау, Тарбагатая, Сайрам-Угама и Каратау. Также дикорастущие формы яблони Сиверса произрастают в Синьцзянской провинции Китая. Современный интерес к яблоне Сиверса вызван тем, что почти все сорта современных яблонь имеют гетероклональное происхождение и являются восприимчивыми к болезням, характеризуются низкой устойчивостью к вредителям .

о Уровень генетического полиморфизма как природных популяций, так и культурных растений наиболее эффективно определяется с помощью ДНК-маркеров. Кроме этого, молекулярные маркеры ит применяются для исследования происхождения, доместикации видов и их последующей миграции, получения информации по филогенетическим взаимоотношениям между видами, а также для географической локализации популяций, имеющих разное генетическое происхождение. Для изучения связей между таксонами растений часто используется анализ полиморфизма нуклеотидных последоваз тельностей уникальных генов, таких как рибосомальные транскрибируемые спейсеры ITS-1 и ITS-2, спейсеры хлоропластного генома и т.д. Однако эти данные не всегда можно экстраполировать на по эволюцию генома в целом, поскольку различные локусы генома эволюционируют с разной скоростью. Применение нейтральных молекулярных маркеров, таких как ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat), сравнительно равномерно распределенных по растительному геному, позволяет одновременно определить изменчивость по группе не связанных между собой локусов, что особенно ценно для Ре сохранения и использования генетических ресурсов [1–3]. Такая информация дает возможность оценить генетический дрейф, происходящий в экосистемах, а также эффективно проводить мониторинг популяций редких и исчезающих видов растений, находящихся на охраняемых территориях .

Известно, что в Казахстане за последние полвека площадь дикоплодовых лесов сократилась примерно на 60–70 % .





Культурные сады в странах Европы, США, Азии многократно обрабатываются от вредителей и болезней в течение года. Последнее связано с тем, что у культурных сортов яблонь отсутствует или ослаблена устойчивость к вредителям, повреждающим листья и плоды, а также возбудителям, вызывающим грибные, бактериальные и вирусные болезни. В связи с этим необходимо провести широкомасштабные исследования по оценке морфологических признаков и помологических характеристик с параллельным проведением молекулярно-генетической паспортизации, осуществляемой посредством исследования полиморфизма ДНК селектируемых и выделенных форм из диСерия «Биология. Медицина. География». № 4(88)/2017 21 А.С. Бахтаулова, Б. Бекманов, Ж.Ж. Канагатов коплодовых лесов Malus sieversii. При этом важно проведение оценки исходных форм вводимых в культуру in vitro и их регенерированных клонов [4–6] .

Дикие виды яблони, несущие гены устойчивости к стрессам абиотического и биотического характера, широко используются при создании исходного материала для новых сортов. По мнению ученых [7], геном растений, вегетативно размножаемых человеком в течение длительного времени и вновь скрещиваемых между собой, представляет сложную гетерозиготную структуру .

Молекулярное маркирование находит широкое применение в различных областях, позволяющих оценить состояние генетических ресурсов популяции различных видов, осуществить обеспечение в ходе проведения селекционных программ, провести анализ объектов семенного фонда .

Применение ПЦР анализа (PCR — polymerase chain reaction) подразумевает использование термостабильной ДНК полимеразы для амплификации in vitro отдельных специфических последоваГУ тельностей или локусов ДНК с применением случайных или специфических праймеров (олигонуклеотидных последовательностей). Амплифицированные фрагменты разделяются электрофоретически, и полосы (пики) выявляются окрашиванием. Предпочтение методов генотипирования с использованием ПЦР обусловлено, прежде всего, потребностью в реакции небольших количеств ДНК (5–100 нг образца на реакцию) .

р Исследованиями [8, 9] установлено, что на молекулярном уровне вид M. sieversii имеет близкое родство с культурными яблонями. В работе, выполненной исследователями из КНР Chunyu Zhang и Ка Xuesen Chen с соавторами [10], получены данные по изучению внутривидового полиморфизма четырех географически изолированных популяций M. sieversii, произрастающих на северо-западе Китая, с использованием SSR маркеров. Chunyu Zhang и Xuesen Chen с соавторами установили наличие у четырех изолированных популяций M. Sieversii 16 идентификационных электрофоретических бэндов (полос). Причем они отмечают, что процент полиморфных бэндов у популяции GL был наиболее высоким (89,06 %), наиболее низкий (78,12 %) — у популяции YM .

й Результаты молекулярной оценки ДНК показали генетическую связь многочисленных культурных сортов, созданных селекционерами США, Канады, Англии, России, Казахстана и других стран .

ри Казахстанскими учеными установлена генетическая связь яблони Сиверса с местными сортами Восход, Алатау, Заман, Апорт и американским сортом Голден делишес [11, 12] .

Для мониторинга состояния природных популяций M. Sieversii и разработки рекомендаций по охране и размножению важна обобщенная генетическая характеристика по типичным для данного о вида популяций ДНК-маркерам .

Методика ит В ходе работы проведен первичный отбор растительных образцов со старовозрастных маточных растений из генетических резерватов для оценки внутривидового разнообразия яблони Сиверса молекулярно-генетическими методами ISSR-маркирования .

Для анализа генетического полиморфизма ДНК нами были взяты образцы листьев, полученные з путем проращивания семян (четыре образца), и листья взрослых деревьев (пять образцов). Контролем служили образцы: № 5 — листья, взятые с наиболее старого маточного растения яблони Сиверса по

–  –  –

Также в работе были использованы зрелые листья, собранные осенью этого года. Перед выделением ДНК все листья тщательно промыты дистиллированной водой и просушены. Выделение геномной ДНК проводили согласно стандартной методике (СТАВ-метод). В основе метода лежит лизис клеток буфером на основе СТАВ (цетилтриметиламмонийбромид, входит в состав многих бытовых моющих средств), депротеинизация хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом. Для выделения использовали 30–80 мг листьев. Количественную и качественную оценку выделенных ДНК проводили с помощью ДНК-фотометра Biofotometer Plus (Eppendorf, Германия) и электрофоретического анаСерия «Биология. Медицина. География». № 4(88)/2017 23 А.С. Бахтаулова, Б. Бекманов, Ж.Ж. Канагатов лиза. Для фотометрического анализа проводили измерение адсорбции водных растворов ДНК при трех длинах волн: 260, 280 и 320 нм. Размер молекул ДНК, так же как наличие примесей РНК, определяли методом электрофореза в 0,7 %-ном агарозном геле после окрашивания бромистым этидием .

Визуализация ДНК, РНК проводилась с использованием гельдокументирующей системой QuantumST5–1100 (Vilber Lourmat, Франция) .

Для подбора молекулярных маркеров (ММ) был проведен предварительный анализ результатов исследований предыдущих исследователей яблони [3, 6, 8, 12]. При подборе праймерных пар были использованы ранее созданные праймеры, имеющиеся в NCBI и подходящие для анализа яблони .

Синтез олигонуклеотидов осуществлялся на синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Новосибирск, Россия) в лаборатории молекулярной генетики Института общей генетики и цитологии КН МОН РК согласно методике, предложенной производителем. Благодаря высокому качеству синтеза получен

–  –  –

сов в 1ХТВЕ буфере, и полосы выявляли окрашиванием бромистым этидием. Спектры документировали с помощью гельдокументирующей системы Quantum-ST5–1100 (Vilber Lourmat, Франция). Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы 25–700 bp DNA Ladder (ThermoScientific, США). Для интерпретации полученных результатов учитывали только наиз более яркие и четкие полосы .

В ряде случаев, особенно при гибридизации близкородственных форм, морфологические разлипо чия вегетативных органов могут быть недостаточны для идентификации гибридных сеянцев. В этих случаях для ранней диагностики и селекции гибридных генотипов могут быть использованы молекулярно-генетические методы. Одним из самых распространенных и информативных методов является анализ электрофоретических спектров межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR). Для Ре оценки вариабельности генома яблони Сиверса был использован именно этот ISSR-анализ с использованием 6 межмикросателлитных маркеров у 10 растений яблони Сиверса. Выбранные ISSRмаркеры характеризовались высоким уровнем информативности. Число ДНК-паттернов на определенный локус варьировало от 1 до 7, что дает возможность сравнить внутри одного вида полиморфизм .

Результаты В результате были получены электрофореграммы продуктов амплификации. Число фрагментов, амплифицируемых праймерами (AG)9C и (GA)9C, выявили полиморфные, а также мономорфные ДНК-фрагменты. В случае (AG)9C с молекулярной массой 450 bp и в случае (GA)9C с молекулярной массой 420 bp фрагменты характеризуются мономорфными, так как эти фрагменты встречаются во всех исследуемых образцах (рис. 3) .

–  –  –

Рисунок 5. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК с праймерами В целом, с учетом полученных результатов все изученные ISSR-маркеры, кроме (TA)8G и (TG)8AA, могут быть рекомендованы при изучении генетического разнообразия яблони Сиверса с использованием ПЦР .

Обсуждение Первичный анализ растительных образцов с маточных деревьев генетических резерватов для проведения оценки внутривидового разнообразия яблони Сиверса по данным молекулярно-генетиВестник Карагандинского университета Молекулярно-генетический анализ … ческого обследования был получен авторами прoeкта ГЭФ/ПРOOН «Сoхрaнeниe in-situ гoрнoгo aгрoбиoрaзнooбрaзия в Кaзaхстaнe» .

Анализ полученных данных показал, что на территории Жонгар-Алатауского ГНПП только труднодоступные и наиболее удаленные резерваты (Кокжота 1, 2) общей площадью 88 га, или 17 %, считаются лучшими насаждениями, не затронутыми процессами генетической эрозии и не содержащими ДНК Malus domestica. В резерватах «Пихтовое и Солдатское ущелья» и «Урочище Крутое» до 30 % семян оказались гибридными c Malus domestica. На генетических резерватах «Чернова речка» и № 1, 2, 3 АЛСЦ генетическая оценка деревьев не проводилась .

Результаты проведенного нами анализа генетического полиморфизма ДНК, выполненного с использованием 6 межмикросателлитных маркеров, позволили идентифицировать отобранные образцы Malus sieversii и объективно охарактеризовать степень их генетического разнообразия. В дальнейшем

–  –  –

ров с комплексом важных признаков. Так, проведенный анализ яблони позволил установить, что исследуемые генотипы содержат большое количество уникальных микросателлитных локусов генома, ит что и представляет интерес для селекционной работы. Результаты такого анализа могут быть основой при выборе родительских форм для скрещиваний. По результатам анализа генетического полиморфизма ДНК наиболее идентичным Malus sieversii являются образцы, взятые со старовозрастных особей генетических резерватов Чернова речка и урочища Крутое и сеянца, выращенного из плодов этих з растений .

В целом результаты работы говорят о высокой перспективности дальнейшего использования по ISSR-маркеров, (AG)9C, (GA)9C, (ТС)8C и (ТG)8А в исследованиях по оценке генетического разнообразия отечественной яблони и подтверждают эффективность применения ДНК-маркерных систем, основанных на анализе полиморфизма межмикросателлитных последовательностей генома .

Исследования выполнены в рамках научного проекта № 0649/ГФ4 ГФ МОН РК .

Ре Список литературы 1 Williams, J.G.K., Kubelik, A.P., & Livak, K.J. et al. (1990). DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18(22), 6531–6535 .

2 Deguilloux, M.F. (2004). DNA-based control of oak wood geographic origin in the context of the cooperage industry. Ann .

For. Sci., 61, 97–104 .

3 Kenis, K., & Keulemans, J. (2005). Genetic linkage maps of two apple cultivars based AFLP and microsatellite markers. Molecular Breeding, 15(2), 205–219 .

4 Tatum, T.C., Stepanovic, S., & Biradar, D.P. et al. (2005). Variation in nuclear DNA content in Malus species and cultivated apples. Genome, 48(5), 924–930 .

Серия «Биология. Медицина. География». № 4(88)/2017 27 А.С. Бахтаулова, Б. Бекманов, Ж.Ж. Канагатов 5 Yamamoto, T., Kimura, T., & Sawamura, Y. et al. (2001). SSRs isolated from apple can identify polymorphism and genetic diversity in pear. Theoretical and Applied Genetics, 102(6), 865–870 .

6 Bendokas, V., Gelvonauskiene, D., & Gelvonauskis, B. et al. (2007). Identification of apple columnar hybrids in juvenile phase using molecular markers. Scientific Works of Lithuanian Institute of Horticulture and Lithuanian University of Agroculture, 26(3), 289–295 .

7 Brisset, M.N., Cesbron, S., Thomson, S.V., & Paulin, J.P. (2000). Acibenzolar-Smethyl induces the accumulation of defenserelated enzymes in apple and protects from fire blight. European Journal of Plant Pathology, 106, 529–536 .

8 Chen, D.M., Zlang, S.L., & Jin, Y.F. (1997). A method for genomic DNA preparation of woody fruit crops. Acta Agriculturae Universitatis Chekianensis, 23(6), 621–624 .

9 Oraquzie, N.C., Gardiner, S.E., & Basset, H.C.M. et al. (2001). Genetic diversity and relationship in Malus sp. germplasm collections as determined by Random Amplified Polymorphic DNA. American Society for Horticultural Science. 126(3), 318–328 .

10 Chunyu, Zh., & Chen, X. (2000). The RAPD evidence for the phylogenetic relationship of the closely related species of cultivated apple. Genet. Res. Crop Evolut., 47(4), 353–357 .

ГУ 11 Saveleva, E.N., & Kudriavtsev, A.M. (2015). AFLP-analiz geneticheskogo raznoobraziia v rode Malus Mill. (Yablonia) [AFLP-analysis of genetic diversity in the genus Malus Mill (Apple tree)]. Genetika. — Genetics, 10, 1126–1133 [in Russian] .

12 Aitkhozhina, N.A. et.al. (2008). Molekuliarno-biologicheskaia otsenka vnutrividovogo raznoobraziia yablon s ispolzovaniem PTsR-analiza [Molecular biological assessment of intraspecific diversity of Apple trees using PCR]. Almaty: Otchet NTI [in Russian] .

<

–  –  –

Malus Sieversii takes a special place among valuable plant species of Zhongar-Alatau State National Natural Park. It forms a significant array of wild fruit trees (1.05 % of park area). The current state of genetic reserves of Sievers apple forests was studied in the park in order to preserve apple forests. We created design and synРе thesis of primers for molecular genetic analysis, determined genetic characteristics of DNA samples using ISSR-markers, analyzed and interpreted results of molecular genetic studies. Molecular genetic analysis of diversity of wild apple trees will provide the basis for sustainable development of Sievers apple natural populations by growing genetically uniform planting material. Researches focus on preserving unique gene pool of apple forests for selection and restoration of cultivars. The studies were carried out within research project No.0649/GF4 of grant funding by MES RK .

Keywords: Sievers Apple, population, preservation, genetic reserve, ISSR-marker, molecular and genetic analysis.




Похожие работы:

«УДК 796.01:642.5 лифановская е. в., бакалавр Голубева Т. Б., канд. техн. наук, доц. УслУГи ЭкоПиТаНиЯ ПредПриЯТиЙ сеЗоННЫХ видов сПорТа 1 Рассмотрена проблема внедрения экоконцепции на предприятия общественного питания, расположенные на локациях сезонных видов спорта Свердловской области. Преимущества предложенного размещения: общность целево...»

«Андрей Янкин Создатель и руководитель эдъюкэйтмент кампуса "Mediademia" (2014) Продюсер, Член Национальной ассоциации продюсеров и кураторов (с 2012 года) Тьютор факультета (ФДИО) Дополнительного и Инновационного образования (Faculty of Additional and...»

«ОБЩЕСТВЕННО-ПОЛИТИЧЕСКАЯ ЛИТЕРАТУРА Философия Мямешева, Галия Хамзеевна. Философияны оыту дістемесі: Теориясы мен тжірибесі [Мтін] : оу-дістемелік рал / Г. Х . Мямешева ; л-Фараби атын. азУ. Алматы : аза ун-ті, 2017. 131, [1] б. Библиогр.: 128-130 б. Рыскиева, Айымжан буызы. Дстрлі трік дниетан...»

«Положение II международного конкурса баянистов и аккордеонистов "AccoPremium 2018" Международный конкурс "AccoPremium", созданный белорусским баянистом, солистом Гомельской областной филармонии, победителем всероссийских и международных...»

«УДК/ББК: 316.454.5;316.485/60.55.373 СОЦИОКУЛЬТУРНЫЙ АНАЛИЗ МЕЖНАЦИОНАЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ В ОРГАНИЗАЦИЯХ ЗАКРЫТОГО ТИПА Грошева Л.И., кандидат социологических наук, ст. преподаватель Тюменское высшее военно-инженерное командное училище имени...»

«Theory and history of culture 57 УДК 008 Publishing House ANALITIKA RODIS (analitikarodis@yandex.ru) http://publishing-vak.ru/ Корючк ина Пол ина Сергеевна Этнический образ в пространстве современной медиакультуры Корючкина Полина Сергеевна Ас...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" (НИУ "БелГУ") ИНСТИТУТ МЕЖКУЛЬТУРНОЙ КОММУНИКАЦИИ И МЕЖДУНАРОДНЫХ ОТНОШЕНИЙ ПОД...»

«УДК 796:379.8(470.54) Пинженина д. в., бакалавр Тропина л. к., канд. пед. наук исследоваНие ПоТреБНосТеЙ ЖиТелеЙ Поселка ГородскоГо ТиПа в акТивНЫХ ФорМаХ сеМеЙНоГо досУГа (На ПриМере ГородскоГо окрУГа реФТиНскиЙ) 1 В работе приведены ре...»







 
2019 www.librus.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - собрание публикаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.